膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒

  本试剂盒 提供独特的组份提取细胞及组织中的膜蛋白。 其原理是裂解细胞后，先离心分离出质膜粗提物，再利用 特殊的 抽提Buffer ，选择性地分离 提取膜蛋白， 抽提 Buffer 含 一种特殊的去污剂，在 4℃ 时所有的蛋白质均可都溶于抽提 Buffer ，但在 37 ℃时，抽提 Buffer 分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中，根椐该性质分离出膜蛋白 。 产物不仅含细胞膜蛋白，也含胞器质膜蛋白。提取方法简单，可靠，快速。 获得的膜蛋白纯度高，可用于PAGE电泳、 Western Blot、免疫共沉淀等后续研究。

三、 蛋白提取 操作步骤

Ⅰ 实体组织蛋白的提取

1 、 组织样本（ 200 ～ 300mg ）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，于冰上剪碎；

2 、 组织样本中加入 1mL Lysis Buffer （注：使用前，每 mL Lysis Buffer 加入 1 μL 蛋白酶抑制剂和 1 μL   1M DTT ） ，置玻璃均浆器冰上均质 30 ～ 50 次（或超声破碎细胞，每次 30 S ， 3 ～ 4 次，每次间隔 1 min ）， 置于冰上冷却 。 均质或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于 90 ％；

3 、 将均浆液转移至冷的离心管中，于 4 ℃ , 3000 rpm 离心 10 min ，弃沉淀；

4 、 取上清转移至新冷离心管中，于 4 ℃ , 14 000 rpm 离心 30 min ，所得上清转至新管中，即为胞浆蛋白，分装冷冻保存；

5 、 取沉淀，加入 1mL 冷的抽提 Buffer ， 涡旋振荡混匀后， 4 ℃ 放置 10 ～ 15min ；

【注：因抽提 Buffer 在室温时会分层，请务必于 4 ℃ 混匀后加入 】 
6 、 4 ℃ , 3000rpm 离心 5min ，取上清转移至新管（注意勿将沉淀带入上清），进行下步提取；

7 、 置于 37 ℃ 水浴 10min ；

8 、 室温 ,13 000rpm 离心 5min ，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；

【注： 建议使用进口透明性较好的微量离心管， 可见下层为含膜蛋白的有机相。上下两层因均为透明，只在交界处有一折光线，需仔细观察才可见到。或室温静置30分钟～ 1 小时亦可见分层。以下亦同。 】

9 、 取下层，加入 500 μL 冰冷灭菌水， 4 ℃ 放置 5min ；

10 、置于 37 ℃ 水浴 10min ；

11 、室温 ,13 000rpm 离心 5min ，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；

12 、取下层，加入 500 μL 冰冷灭菌水， 4 ℃ 放置 5min ；

13 、置于 37 ℃ 水浴 10min ；

14 、室温 ,13 000rpm 离心 5min ，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；

15 、最终得到的下层即为膜蛋白提取物， BCA 法测定蛋白含量（因残留有机相可能影响测定结果，此含量为相对参考值），分装冷冻保存。

Ⅱ   培养细胞蛋白提取

1 、 收集不少于 1 ×10⁷ 细胞 ，用冷 PBS （ pH7.4 ）洗涤细胞两次（每次 3000 rpm 离心 5 min ）；

2 、 在细胞样本中加入 1mL Lysis Buffer （注：使用前，每 mL Lysis Buffer 加入 1 μL 蛋白酶抑制剂和 1 μL   1M DTT ）， 置玻璃均浆器冰中均质 30 ～ 50 次（或超声破碎细胞，每次 30 S ， 3 ～ 4 次，每次间隔 1 min ）， 置于冰上冷却 。 均质或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于 90 ％；

3 、 将均浆液转移至冷的离心管中，于 4 ℃ , 3000 rpm 离心 10 min ，弃沉淀；

4 、 取上清转移至新冷离心管中，于 4 ℃ , 14 000 rpm 离心 30 min ，所得上清转至新管中，即为胞浆蛋白，分装冷冻保存；

5 、 取沉淀，加入 1mL 冷的抽提 Buffer ， 涡旋振荡混匀后， 4 ℃ 放置 10 ～ 15min ；

【注：因抽提 Buffer 在室温时会分层，请务必于 4 ℃ 混匀后加入 】 
6 、 4 ℃ , 3000rpm 离心 5min ，取上清转移至新管（注意勿将沉淀带入上清），进行下步提取；

7 、 置于 37 ℃ 水浴 10min ；

8 、 室温 ,13 000rpm 离心 5min ，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；

【注： 建议使用进口透明性较好的微量离心管， 可见下层为含膜蛋白的有机相。上下两层因均为透明，只在交界处有一折光线，需仔细观察才可见到。或室温静置30分钟～ 1 小时亦可见分层。以下亦同。 】

9 、 取下层，加入 500 μL 冰冷灭菌水， 4 ℃ 放置 5min ；

10 、置于 37 ℃ 水浴 10min ；

11 、室温 ,13 000rpm 离心 5min ，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；

12 、取下层，加入 500 μL 冰冷灭菌水， 4 ℃ 放置 5min ；

13 、置于 37 ℃ 水浴 10min ；

14 、室温 ,13 000rpm 离心 5min ，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；

15 、最终得到的下层即为膜蛋白提取物， BCA 法测定蛋白含量（因残留有机相可能影响测定结果，此含量为相对参考值），分装冷冻保存。

四、 SDS  PAGE 电泳操作步骤

1 、 进行 PAGE 电泳前，取该提取物， 每 100 μL 膜蛋白提取物，加入约 300 μL 的溶解 Buffer 和约 100 μL 三氯乙酸 （ TCA ）试剂， 混匀后置冰上 2 0 ～ 30 min 后， 13 000rpm ，离心 15 min ，尽可能除去上清；

2 、 沉淀加入 1mL 丙酮，室温静置 10min 后， 13 000rpm 离心 15 min ；

3 、 弃上清， 沉淀真空旋干或 置冰上干燥约 10 min （敞开离心管盖） ，加入适当体积的 Loading Buffer （使用前每 100 μL Loading Buffer 加入 2 ～ 5 μL 巯基乙醇）溶解，彻底分散（枪头反复吹吸或剧烈涡旋）；

【注：加入 Loading Buffer 后如有部分难溶物，可取上清继续上样；如 加入 Loading Buffer 后溴酚蓝转呈黄色，此为少量 TCA 残留所致，不影响电泳结果。请参照 Marker 标准。 】

4 、 上样进行 SDS PAGE 电泳 。