磷酸化蛋白提取试剂盒

储存条件：

-20℃保存。

有效期：

一年。

注意事项：

1.     旋帽离心管装的微量试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

2.     实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。

3.     整个过程须保持样品处于低温状态。

4.     不论是细胞或组织样本，应充分保证蛋白样本的新鲜。组织离体后应当立即放到液氮中保存，长期保存的话最好也在液氮中（如果无液氮条件则放置-80℃）。

5.     避免蛋白的反复冻融。

6.     电泳buffer中也可加入Na₃VO₄。

7.     本提取配方中含有蛋白激酶及磷酸酶这两种酶的抑制剂，因此不能用于蛋白激酶和磷酸酶这两种酶的免疫共沉淀实验。

产品简介：

本试剂盒提供全套试剂，适用于从各种原代或传代细胞和各种实体软组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织中提取具有活性的磷酸化蛋白。提取过程简单方便，可在1小时内完成。该试剂盒含有的酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。本试剂盒含有的独特配方能够溶解细胞膜包括细胞质膜和核膜。提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫共沉淀等蛋白研究。

产品特点：

1、  从细胞，组织中提取蛋白不需要经过前处理。

2、  将蛋白提取的时间缩短至30分钟-1小时。

3、  含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。

4、  紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

5、  蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

使用方法：

A．细胞磷酸化蛋白提取

1.       裂解液制备：每500ul冷的Buffer I中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

2.       取5-10×10⁶个细胞，在4℃，1000rpm条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

3.       用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

4.       每5×10⁶个细胞中加入500ul冷的裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15-20分钟。

5.       在4℃，14000rpm条件下离心15分钟。

6.       快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到磷酸化蛋白。

B． 组织磷酸化蛋白提取

1.       裂解液制备：每500ul冷的Buffer I中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

2.       取100mg组织样本剪碎，用液氮研磨后，加入裂解液。（如果没有条件液氮研磨，也可用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。）

3.       将组织的裂解液（或组织匀浆）吸入另一预冷的干净离心管中，在4℃，10000rpm条件下离心5分钟。

4.       将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到磷酸化蛋白。

上述磷酸化蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用。